دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبيعي ساري
دانشکده علوم زراعي
گروه زراعت و اصلاح نباتات
پايان نامه دوره کارشناسي ارشد در رشته مهندسي کشاورزي گرايش بيوتکنولوژي
موضوع:
مطالعه ژنتيکي و نقشه يابي ژن رنگ پايه ساقه با استفاده از نشانگرهاي مولکولي ريزماهواره (SSR) در برنج
اساتيد راهنما:
دکتر غلامعلي رنجبر
دکتر قربانعلي نعمت زاده
استاد مشاور:
دکتر غفار کياني
نگارش:
طاهره ابراهيمي
شهريور 1389
ساعتها را
بگذاريد بخوابند،
بيهوده زيستن را
نيازي به شمردن
نيست.
گر باطن را نميتوان ساقط کرد ميتوان رسوا ساخت اگر حق را نميتوان استقرار بخشيد، ميتوان اثبات کرد و به زمان شناساند و زنده نگاه داشت.
دکتر علي شريعتي
زندگي كوتاهتر از آن است كه به خصومت بگذرد و قلبها گراميتر از آنند كه بشكنند آنچه از ‏روزگار به دست ميآيد با خنده نميماند و آنچه از دست برود با گريه جبران نميشود فردا خورشيد طلوع خواهد كرد حتي اگر ما نباشيم.
سپاسگزاري
سپاس خدايي را كه سخنوران در ستودن او بمانند و شمارندگان در شمردن نعمتهاي او ندانند وكوشندگان حق او را گذاردن نتوانند.
خدايي كه پاي انديشه تيز گام در راه شناسايي او سنگ است و شير فكرت ژرف رو به درياي معرفتش بر سنگ، صفتهاي او تعريف نشدني و به وصف درنيامدني و در وقت ناگنجيدني و به زماني مخصوص نابودني.
خدايا ! تو را سپاسگزارم كه مرا ياري كردي تا به روياي دنيويم رنگ واقعيت بپوشانم و به اندازه لياقتم بر من ارزاني نمودي.
هر چند واژهها را ياري آن نيست که لطف، محبت و بزرگواري کساني را که در تمام دوران زندگيم جرعه نوش درياي بيکران مهر و محبتشان بودهام به تصوير بکشند، به رسم ادب و احترام، بوسه بر دستشان زده و بر خود واجب ميدانم زحمات و ارشادات کليه اساتيد بزرگوارم را ارج نهاده و مراتب تشکر قلبي و باطني خويش را از الطاف و مهربانيهاي آنها ابزار نمايم.
در آغاز لازم مي دانم از زحمات پدر و مادر گراميام و کليه کساني که در دوران تحصيل همواره مشوق و پشتيبان اينجانب بوده اند کمال تشکر را بنمايم. همچنين از زحمات اساتيد محترم و دانشجويان صميمي و مهربان دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبيعي ساري کمال تشکر و سپاسگزاري را دارم.
از زحمات، راهنمائيها و مشاورتهاي ارزشمند اساتيد همت و زندگي جناب دکتر غلامعلي رنجبر و دکتر قربانعلي نعمت زاده که با راهنماييها و نظرات گهربار خود راهگشاي اينجانب بودهاند کمال تشکر را دارم. انجام اين پژوهش بدون کمک فکري، همکاري و همدلي اين اساتيد متواضع و انديشمند غير ممکن مينمود و همنشيني و شاگردي آنان را که از بزرگترين افتخارات و شيرينترين لحظات زندگي من ميباشد، منت دار محبتهاي کارساز مهربان هستم.
بر خود ميدانم كه از زحمات بيدريغ، تلاشهاي بيوقفه و راهنماييهاي ارزشمند استاد گرامي جناب آقاي دكترغفار کياني که در طول يك سال گذشته با نظرات شيوا و راهگشايشان بر غناي علمي اين تحقيق افزودند تشكر و قدرداني نمايم.
از صبر و بردباري اساتيد بزرگوار جناب آقاي دکتر نجفي و باقري که زحمت مطالعه و داوري اين رساله را بر عهده داشتند بسيار سپاسگزارم.
همچنين از مسئولين محترم پژوهشکده برنج و مرکبات، آقايان مهندس هاشمي و علوي به واسطه کمک هاي علمي و زحمات بي دريغشان کمال تشکر و قدرداني را دارم.
از حمايتهاي مالي پژوهشکده برنج و مرکبات دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبيعي ساري درکليه مراحل اين پژوهش بينهايت سپاسگزارم.
تقـديم به:
پدر و مادر عزيزم
به پاس تعبير عظيم و انسانيشان از کلمه ايثار و از خودگذشتي
به پاس عاطفه سرشار و گرماي اميدبخش وجودشان که در اين روزگار سرد بهترين پشتيبان است
به پاس قلب هاي بزرگشان که فريـاد رس است و سرگرداني و ترس در پنـاهشان به شجـاعت مي گرايد
و به پاس محبت هاي بي دريغشان که هرگز فروکش نمي کند
والديني که بودنشان تاج افتخاري است بر سرم و نامشان دليلي است بر بودنم چرا که اين دو وجود پس از پروردگار مايه هستي ام بوده اند، دستم را گرفتند و راه رفتن را در اين وادي زندگي پر از فراز و نشيب آموختند.
آموزگاراني که برايم زندگي، بودن و انسان بودن را معنا کردند.
مطالعه ژنتيکي و نقشه يابي ژن رنگ پايه ساقه با استفاده از نشانگرهاي مولکولي ريزماهواره (SSR) در برنج
چکيده:
وجود رنگدانههاي آنتوسيانين در برنج عامل اصلي توليد پايه ساقه ارغواني رنگ محـسوب ميشود. رنگ پايه ساقه در برنج رابطه مستقيم و قوي با تشکيل دانههاي رنگي در برنج دارد که در زير پوسته آنها به دليل تراکم متفاوت رنگيزههاي آنتوسيانين در لايههاي مختلف پريکارپ، پوشش دانه و آلورون، رنگهاي سرخ، ارغواني و سياه مشاهده ميشود. بمنظور درک درست از مسير بيوسنتزي آنتوسيانين که اطلاعات مفيدي را در زمينه بيولوژي مولکولي و ژنتيک برنج به همراه خواهد داشت، الگوي تفرق ژن رنگ پايه ساقه با استفاده از تعداد 123 تک بوته از جمعيتF2 حاصل از تلاقي 18-33 – DN و ندا مورد مطالعه قرار گرفت. ارزيابي تک بوتههاي F2 بر اساس رنگ پايه ساقه نشان داد تعداد 83 بوته رنگي (ارغواني) و تعداد 40 بوته بيرنگ توليد شده نسبت تفرق 1 :075/2 را ايجاد مينمايد. آماره ?2 اين نسبت تفرق برابر 48/3 بود که از نسبت تفکيک 3:1 اختلاف معني داري را نشان نداد (95/0p < ). در نتيجه ثابت شد که صفت مورد نظر از سيستم کنترل تک ژني تبعيت مينمايد. مطالعات انجام شده با استفاده از 59 نشانگر مولکولي ميکروساتليت ميزان 28 درصد چند شکلي بين والدين را نشان داد و آناليز پيوستگي روي تک بوتههاي مغلوب جمعيت F2 از تلاقي ندا × 18-33 – DNثابت کرد که ژن رنگ پايه ساقه بر روي بازوي کوتاه کروموزوم شماره 6 برنج با نشانگرRM253 که در فاصله 15 سانتي مورگان از ژن قرار دارد همبسته مي باشد.

واژههاي كليدي:
برنج، رنگ ساقه، نشانگرهاي SSR.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول
مقدمه
1-1- توليدکنندگان برنج2
1-2- کشت برنج در ايران2
1-3- متابوليتهاي ثانويه درگياهان3
1-4- تهيه نقشههاي ژنتيک4
فصل دوم
کليات و مرورمنابع
2-1- مشخصات گياهشناسي برنج7
2-2- وضعيت ژنتيکي برنج7
2-3- مهندسي توليد متابوليتهاي ثانويه درگياهان8
2-4- ژنهاي مسئول بيوسنتز فلاوونوئيدها و آنتوسيانينها9
2-5- برنج رنگي11
2-6- نشانگرها در برنامههاي اصلاحي12
2-6-1- تعريف نشانگر12
2-6-2- انواع نشانگرها13
2-6-2-1- نشانگرهاي موفولوژيکي13
2-6-2-2- نشانگرهاي سيتوژنتيکي13
2-6-2-3- نشانگرهاي بيوشيميايي14
2-6-2-4- نشانگرهاي مولکولي14
2-6-2-4-1- نشانگرهاي مولکولي مبتني بر DNA 15
2-6-2-4-1-1- نشانگرهاي مولکولي مبتني بر هيبريداسيون15
2-6-2-4-1-2- نشانگرهاي مولکولي مبتني بر واکنش زنجيرهاي پليمراز16
2-6-2-4-1-3- نشانگرهاي مولکولي مبتني بر PCR و هيبريداسيون16
2-6-2-4-1-4- نشانگرهاي مبتني بر توالييابي (SNPها) و تراشه DNA17
2-7- کاربرد نشانگرهاي مولکولي17
2-8- انتخاب ميان انواع مختلف نشانگرها19
2-9- کاربرد نشانگرهاي مولکولي در برنج19
2-10- انتخاب به کمک نشانگرها21
2-11- استفاده از نشانگرهاي مولکولي درتهيه نقشه ژنتيکي21
2- 12- ريزماهواره22
2-12-1- تشخيص آللهاي ريزماهواره24
2-12-2- مزاياي نشانگرهاي ريزماهواره24
2-12-3- مشکلات کار با ريزماهواره25
2-12-3-1- اشتباهات آلل خواني25
2-12-3-2- آللهاي صفر26
2-12-3-3- اندازه نمونه مورد نياز26
2-12-4- ريزماهوارهها درگياهان و برنج27
2-12-5- کاربردهاي ريزماهواره28
2-13- نقشههاي پيوستگي ژنتيکي28
2-14- ويژگيهاي نقشه29
2-15- سابقه نقشه يابي صفت رنگ دربرنج30
2-15-1- ارتباط بين رنگ پريکارپ وصفت گلوتيوز33
2-15-2- توارث رنگ نوک دانه و ارتباط آن با صفات ديگر33
2-15-3- روابط بين رنگ کلاله با صفات ديگر34
2-15-4- ارتباطات بين رنگ پوشبرگ و صفات ديگر34
2-15-5- ارتباط بين رنگ کلاله و رنگ پوشبرگ35
2-15-6- ارتباط بين رنگ زبانک با صفات ديگر35
2-15-7- ارتباطات بين رنگ زبانک و رنگ پريکارپ35
2-15-8- نشاندار کردن ژنهاي مهم اقتصادي و انتخاب به کمک نشانگر (همراه)36
2-15-9- مطالعه ژنتيکي و نشاندارکردن ژن صفت رنگ در برنج37
فصل سوم
مواد و روشها
3-1- مواد گياهي41
3-1-1- رقم 18-33DN-41
3-1- 2- رقم ندا42
3-2- کشت والدين و جمعيت F243
3-3- تهيه نمونه برگي43
3-4- ارزيابي صفت44
3-5- استخراج DNA 44
3-5-1- روش استخراج DNA45
3-6- بررسي کميت و کيفيت DNA استخراج شده49
3-6-1- ازطريق اسپکتروفتومتر49
3-6-2- به وسيله الکتروفورز ژل آگارز49
3-7- بارگذاري نمونهها و اجراي الکتروفورز50
3-8- آماده سازي آغازگرهاي ريزماهواره51
3-9- انجام واکنش PCR53
3-10- تجزيه وتحليل داده ها54
فصل چهارم
نتايج و بحث
4-1- ارزيابي فنوتيپي57
4-2- ارزيابي مولکولي58
4-2-1- غربال والدين58
4-2-2- تحليل لينکاژ60
4-3- ارزيابي نشانگر RM253 در ارقام ديگر برنج64
فصل پنجم
پيشنهادات68
منابع 70
ضمائم
ليست پرايمرهاي بکار رفته در پژوهش79
تهيه محلولهاي مادري81
ماتريس دادههاي مولکولي و فنوتيپي83
چکيده انگليسي
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 3-1. لاين 18-13-DN41
شکل 3-2. والد 18-13-DN با پايه ساقه سبز رنگ42
شکل 3-3. لاين ندا42
شکل 3-4. والد ندا با پايه ساقه ارغواني رنگ43
شکل3-5. عمليات نمونه برداري از نمونههاي برگي برنج دو هفته پس از نشاء44
شکل 3-6. پودر کردن نمونههاي برگي با استفاده از ازت مايع46
شکل 3-7. سانتريفيوژ کردن نمونهها47
شکل 3-8. تشکيل سه فاز مشخص پس از افزودن کلروفرم و جدا نمودن فاز رويي47
شکل 3-9. تشکيل کلاف DNA پس از مصرف ايزوپروپانول48
شکل 3-10. افزودن TE به رسوب DNA و نگهداري آنها در فريزر 20-48
شکل 3-11 . بارگذاري نمونه ها در ژل آگارز51
شکل3-12 . نمونه هايي ازDNA ژنومي که به روشCTAB استخراج شده است.52
شکل3-13. عمليات انجام PCR 54
شکل 4-1. الگوي نواربندي بين والدين مورد مطالعه با تعدادي از نشانگرهايSSR مورد مطالعه60
شکل 4-2. الگوي نوار بندي بين والدين مورد مطالعه با تعدادي از نشانگرهاي SSR مورد مطالعه60
شکل 4-3. الگوي نواربندي بين والدين مورد مطالعه در 10 گياه داراي پايه ساقه سبز با استفاده از نشانگرRM135861
شکل4-4. الگوي نواربندي بيـن والدين مورد مطالعـه در گياهان داراي پايـه ساقه سـبز و ارغوانـي بـا استفاده ازنشانگر RM44362
شکل 4-5. الگوي نواربندي بين والدين مورد مطالعه با 10 گياه با پايه ساقه سبز با استفاده از نشانگر RM25362
شکل4-6. نحوه تعيين ژنوتيپ تعدادي از محصولات واکنـش زنجيرهاي پليمراز نشـانگر RM253 در جمعيـتي از بوتههاي F2 بر روي ژل آگارز63
شکل 4-7 .آناليز ارقام داراي پايههاي ارغواني و سبز با پرايمر RM25365
شکل 4-8. نقشه ژنتيکي نشانگر RM253 روي بازوي کوتاه کروموزوم 666
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول2-1. ليست ژنهاي نشاندار شده توسط مارکرهاي مولکولي در برنج38
جدول3-1. درجه حرارت و زمان بهينه شده در مراحل مختلف واکنش PCR54
جدول3-2. مقادير بهينه شده مواد واکنش زنجيره اي پليمراز55
جدول 4-1. آماره محاسباتي ?2 با درجه آزادي 1 براي صفت رنگ پايه ساقه در جمعيت F257
جدول 4-2. نشانگرهاي پليمورف به کار رفته در اين تحقيق59
جدول 4-3. آزمـون2? بـراي مقايـسـه فـراوانيهاي ژنوتيپي نشـانگر RM253 با فراوانيهاي مورد انتظار 1:2:1 در جمعـيت F263
فصل اول
مقدمه
1-1- توليد کنندگان برنج
برنج پس از گندم دومين غله مهم در دنيا به حسـاب ميآيد و به عنوان يکي از مهمترين محصولات استراتژيک جهان از اهميت و جايگاه ويژهاي برخوردار است، نزديک به 90 درصد سطح زير کشت و توليد برنج متعلق به کشورهاي خاور دور ميباشد. بيش از نصف محصول برنج دنيا در دو کشور هند و چين توليد ميشود. به طور کلي، کشورهاي گرمسيري و نيمه گرمسيري برمه، تايلند، ويتنام، لائوس، اندونزي، فيليپين، پاکستان، هند، آمريکا، ژاپن، ايتاليا، مصر، چين، برزيل، کوبا، مکزيک و استراليا از توليدکنندگان عمده برنج به شمار ميآيند. ميزان توليد برنج در تايلند، برمه، ويتنام و لائوس بيش از مصرف داخلي آنهاست و بنابراين نزديک به 90 درصد برنج موجود در بازارهاي دنيا متعلق به اين 4 کشور ميباشد (53).
1-2- کشت برنج در ايران
کشت برنج در ايران در نواحي شمالي و در نواحي جنوبي به ويژه خوزستان تاريخچه طولاني دارد. شواهد نشان ميدهد که اين محصول در اين ناحيه، قرنها پيش از ميلاد مسيح و در زمان هخامنشيان رواج داشته است. در ايران اسلامي نيز علي رغم دستاوردهاي خوب تحقيقاتي و قريب به 600 هکتار زير کشت برنج، متاسفانه به دليل استفاده ناصحيح و توسعه محدود ارقام اصلاح شده و با توجه به رشد روز افزون جمعيت ايران، توليد داخلي برنج پاسخگوي نياز مردم نيست و مقادير قابل توجهي از خارج وارد ميشود. افزايش توليد به دو روش افزيش سطح زير کشـت و افزايش در واحد سطـح امـکانپذير ميباشد. بدليل محدود بودن زمينهاي زراعي و نيز کمبود شديد آب، بدون ترديد بايد توليد را در واحد سطح با استفاده از روشهاي بهزراعي و بهنژادي افزايش داد. دستيابي به خودکفايي در توليد برنج و حفظ ثبات قيمت آن، از جمله اهداف مهم در کشورهاي کم درآمدي است که برنج بعنوان تنها غذاي اصلي، اساس تأمين نيازهاي غذايي بوده و براي مردم فقير و آسيب پذير اين کشورها شغل و درآمد ايجاد مينمايد(53).
1-3- متابوليتهاي ثانويه در گياهان
بعضي از موجودات زنده خصوصاً گياهان، طيف وسيعي از ترکيبات موسوم به متابوليتهاي ثانويه را توليد ميکند. در مفهوم کلي، متابوليتهاي ثانويه ترکيبات آلي هستند که نقش ضروري در رشد و نمو موجود زنده ندارند. با مطالعاتي که تا کنون صورت گرفته است، به نظر ميرسد که متابوليتهاي ثانويه به عنوان مواد طبيعي نقش اکولوژيکي مهمي در واکنشهاي دفاعي گياهان و همچنين گرده افشاني و انتشار دانههاي گياهان به وسيله حشرات و حيوانات دارند. بعضي از اين ترکيبات به عنوان علفکش و حشره کش در صنعت استفاده ميشوند در حالي که برخي ديگر کاربرد صنعتي ندارند. دسته بزرگي از متابوليت هاي ثانويه کاربرد دارويي و پزشکي دارند. ترکيبات ديگري از اين گروه نيز نقش مهمي در تغذيه انسان و دام و كيفيت مواد غذايي (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند (72).
به دليل كاربردهاي فراوان، متابوليتهاي ثانويه موضوع جالبي براي تحقيقات اصلاح نباتات از طريق روشهاي مولكولي و مهندسي ژنتيـك محسـوب ميشوند. مطالعه در زمينه وظايف اين تركيبات در گياهان، يك موضوع جالب و مهم براي بسياري از پروژههاي تحقيقاتي شده است و نقش تعدادي از اين تركيبات مورد بررسي و تحقيق قرار گرفته است.
در ده سال گذشته تحقيقات چنداني در ارتباط با متابوليتهاي ثانويه انجام نشده است. مانع بزرگ در انجام اين تحقيقات اطلاعات اندك از مسيرهاي توليد زيستي متابوليتهاي ثانويه و برهم كنش آنزيمهاي درگير در اين مسير همچنين اطلاعات محدودي از ژنهاي مربوط به متابوليتهاي ثانويه در دسترس است. يكي از مسيرهايي كه مطالعات بيشتري در سطح ژنهاي دست اندركار آن نسبت به ديگر متابوليتهاي ثانويه انجام شده است، مسيـر توليد فلاوونوئيدها و آنتوسيـانينها است (20). اكثـر ژنهاي درگير در مسير توليد آنتوسيانينها همسانهسازي شده و مطالعات فراواني در سطح بيوشيميايي، مولكولي و ژنتيك اين دست از متابوليتهاي ثانويه صورت گرفته است. يكي از مهمترين دلايل مطالعات بيشتر در اين زمينه، آساني بررسي اين مواد از روي رنگ گلها، نوک دانه و پايه ساقه در گياهاني همچون برنج است که بر اساس فنوتيپ قابل ارزيابي است (73). هدف از مهندسي ژنتيك مسير يك متابوليت ثانويه، افزايش مقدار يك ماده خاص يا گروهي از تركيبات و يا حتي كاهش مقدار اين تركيبات است. براي دستيابي به هدف دوم كه كاهش ميزان توليد يك ماده خاص يا گروهي از مواد ناخواسته است، راههاي مختلفي وجود دارد. اين مواد ممكن است تركيبات سمي در يك محصول گياهي، مواد مانع خالص سازي يك فرآورده صنعتي يا موادي از اين دست باشد. يكي از اين راهها، مسدود كردن يك مرحله از مسير توليد متابوليت ثانويه و مختل كردن توليد يا فعاليت آنزيم مربوط به آن مرحله است. اين هدف ميتواند با كاهش ميزان mRNA مسئول توليد اين آنزيم، با استفاده از فناوري آنتيسنس، RNAi يا بيان بالاي يك آنتيبادي عليه آنزيم مسئول محقق شود. فناوري آنتيسنس براي تغيير رنگ به طور گستردهاي استفاده شده است. راههاي ديگر دستيابي به اين هدف، تغيير مسير به سوي مسيرهاي موازي يا افزايش كاتابوليسم محصول نهايي است. اما ممكن است هدف از انجام تحقيقات، افزايش توليد يك تركيب خاص در گياه بوده يا انتقال ژنهاي مربوط به مسير توليد يك متابوليت ثانويه به يك گياه يا يك ريزسازواره مورد نظر باشد. همچنين ممكن است توليد يك ماده جديد كه به صورت طبيعي در گياهان توليد نشود هدف يك پروژه توليدي- پژوهشي باشد. در بـرخي روشها با تغيير ميزان بيان يك يا چند ژن، بر موانع توليد يك ماده غلبه مي كنند و در روش هاي ديگر، با حذف مسيرهاي موازي (رقابتي) يا كاهش كاتابوليسم ماده مورد نظر، مقدار آن ماده را در گياه ميافزايند. ايجاد تغييراتي در بيان ژنهاي تنظيمي كه كنترل مسير توليد زيستي متابوليتهاي ثانويه را برعهده دارند نيز از جمله روشهاي افزايش يا كاهش توليد تركيب مورد نظر است.
1-4- تهيه نقشههاي ژنتيک
ريشه بسياري از محدوديتهاي روشهاي مختلف اصلاح نباتات، نبود زير بنا و مقدمات ضروري اساسي براي مطالعات ژنتيک است. يکي از اجزاي کليدي و زير بنايي و ابزار اساسي مورد نياز برنامه-هاي آينده اصلاح نباتات، تهيه نقشههاي ژنتيک است. شايد يکي از مهمترين کاربرد نشانگرهاي DNA تهيه نقشه-هاي ژنتيک باشد که براساس آن ميتوان جايگاه ژني و کروموزومي ژنهاي تعيين کننده صفات مطلوب (ترتيب و فاصله ژنها و نشانگرها از يکديگر بر روي کروموزوم ها) را تعيين کرد.
با دانستن جايگاه يک ژن روي نقشه ژنتيک، ميتوان از نشانگرهاي مجاور آن براي احراز جود يک صفت متناظر استفاده کرد. بدين ترتيب نيازي به انتظار براي ظهور آثار ژن نيست. با استفاده از نشانگرهاي DNA مي توان صفات و مشخصات آينده يک نشاي برنج را پيش بيني کرد. در نتيجه تاثيري مثبتي بر اصلاح و پيشبرد گياه دارد.
هدف از اين پژوهش، مطالعه ژن کنترل کننده رنگ پايه ساقه در ژنوم برنج و شناسايي جايگاه ژنومي آن از طريق مارکرهاي همبسته و ارزيابي نشانگرهاي مولکولي ريزماهواره در شناسايي ارقام داراي ژن کنترل کننده رنگ پايه ساقه ميباشد. اين مطالعه پيش نياز مطالعات مولکولي بوده و مواد اصلاحي با ارزشي را براي آنها از طريق شناسايي نشانگرهاي مولکولي همبسته با ژن فراهم ميآورد.
فصل دوم
کليات و مرور منابع
2-1- مشخصات گياهشناسي برنج
برنج يکي از گياهان تيره غلات و متعلق به Poaceae (Gramineae) و قبيله Oryzae است، داراي جنسها و گونههاي زيادي است که مهمترين آن جنس Oryza sativa است.
ساقه برنج1 راست، استوانهاي و جز در قسمتي که گرهها وجود دارد توخالي است. ارتفاع ساقه از 60 تا 200 سانتيمتر متفاوت ميباشد. برنج علاوه بر ساقه اصلي، 4 تا 5 ساقه فرعي دارد. برگهاي برنج بصورت متناوب در دو توالي در دو طرف ساقه قرار گرفتهاند. برگ برنج داراي غلاف، پهنک، زبانک و گوشوارک است. همچنين برنج مانند گندم، داراي گلآذين خوشهاي ميباشد که دانهها در آن قرار مي گيرند. سنبلهها به طور انفرادي و با فاصله کم روي پانيکل قرار گرفتهاند. هر سنبلچه شامل يک عدد گلچه بارور است و هر گلچه داراي دو گلوم کوتاه ميباشد. برخلاف سنبلچههاي گندم، جو و ذرت که فشرده و نزديک بهم هستند، سنبلچههاي برنج بصورت غيرفشرده روي محورهاي اصلي و فرعي گلآذيـن قرار مي گيرد. خوشه برنج داراي گلهاي دوجنسي انفردي است که در خوشچههاي تک گلي قرار دارند (4).
جنس اوريزا که بعنوان گياه زراعي مورد کشت و کار قرار ميگيرد ديپلوئيد (2n=24) بوده و داراي شش پرچم است. برنج زراعي داراي سه زير گونه به نام هندي (اينديکا)، ژاپني (ژاپونيکا) و جاوهاي (جاوانيکا) ميباشد که هر يک داراي ويژگيهاي مورفولوژي خاصي هستند.
2- 2- وضعيت ژنتيکي برنج
برنج امروزه بعنوان يک سيستم براي آناليز ژنتيکي و کاربردهاي بيوتکنولوژي به منظور توسعه و پيشرفت تکلپهها کاربرد دارد. عواملي که اين شرايط را فراهم ميآورند شامل کوچک بودن اندازه ژنوم برنج که تنها شامل 430 ميليارد باز است و مقايسه ژنوم آن در مقايسه با بقيه گندميان و راحتي تغيير شکل آن است (2). بدليل کوچکي اندازه ژنوم، مطالعات ژنتيکي بسياري روي آن انجام گرفته است.
جنس Oryza داراي بيست گونه با تعداد کروموزومهاي پايه 12 ميباشد. اين جنس شامل گونه هاي ديپلوئيد و تتراپلوئيد با شش گروه ژنومي A، B، C، D، E و F ميباشد. گونههاي تتراپلوئيد آن با 48 کروموزوم نيز موجود است (2).
گونه زراعي O. sativa (2n=2x=24) داراي فرمـول ژنـومي AA ميباشد. کرومـوزومهاي گونـه O. glaberrima (2n=2x=24) بخوبـي بـا O. sativa جفت نـشده و لذا به آن فرمـول ژنـومي AgAg دادهانـد. شش گـروه اوريـزا، يـکسالـه و بـقيـه چـند سـاله (دايـمي) ميباشنـد. دو گونـه O. nivara وO. rufipogon که وحشي بوده و داراي ژنوم AA ميباشد، بطور وسيعي در جنوب شرقي آسيا توزيع يافته و به راحتي با يکديگر و با برنج زراعي تلاقي پذير است (2 و 16).
2-3- مهندسي توليد متابوليت هاي ثانويه در گياهان
متابوليتهاي ثانويه وظايف مختلفي در طول چرخه زندگي گياه دارند. از جمله اين وظايف انجام نقش تركيبات واسطه در برهم كنش گياه و محيط اطرافش و برهم كنش گياه با حشرات، ريز سازوارهها و ساير گياهان است. همچنين ممكن است توليد متابوليتهاي ثانويه بخشي از سامانه دفاعي گياه باشد. اين تركيبات در توليد مثل گياه نيز نقش دارند كه از طريق جذب حشرات گرده افشان اين كار را انجام مي دهند. متابوليتهاي ثانويه گياهي نقش مهمي در كيفيت مواد غذايي (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند. همچنين رنگ گياهان زينتي و گلبرگ گلها كه مهمترين خاصيت اين دسته از گياهان است، توسط متابوليتهاي ثانويه ايجاد مي شود. بسياري از متابوليتهاي ثانويه براي توليد دارو، رنگ، حشره كشها، طعم دهندههاي غـذايي و عطـر اسـتفاده مي شوند (72) .در حال حاضر دستاوردهاي زياد و گوناگوني در مهندسي متابوليك متابوليتهاي ثانويه به دست آمده است. مسيرهاي بيوشيميايي مختلفي با استفاده از ژنهاي رمزكننده آنزيمهاي مهندسي شده و پروتئينهاي تنظيمي بررسي شدهاند. در عين حال از ژنهاي آنتيسنس2(در يک آزمايش آنتي سنس، ژني که بايد کلون شود را در جهت معکوس به يک حامل متصل ميکنند، به اين ترتيب وقتي ژن کلون شده رونويسي شد، RNA ساخته شده مکمل معکوس mRNA ايجاد شده توسط نسخه طبيعي ژن است. به اين رشته مکمل معکوس، RNA آنتي سنس مي گويند) نيز براي مسدود كردن مسيرهاي بيوشيميايي و افزايش توليد متابوليت ثانويه خاصي استفاده ميشود (1) که يکي از موفقيت آميزترين روشها براي غير فعال کردن ژن مورد نظر در يک گياه است.
2-4- ژنهاي مسئول بيوسنتز فلاوونوئيدها و آنتوسيانينها
رنگدانههاي3 آنتوسيانين، تنوع رنگي از قرمز روشن، ارغواني تا آبي را نمايش ميدهند و به گروه کلي رنگدانههاي گياهي به نام فلاونوئيدها بعنوان يک متابوليت ثانويه تعلق دارند (33). بيوسنتز فلاوونوئيد و آنتوسيانين از اولين مسيرهاي متابوليتهاي ثانويه بود كه مهندسي ژنتيك آنها صورت گرفت. دليل اين موضوع اين بود كه مسير بيوسنتز آنها به خوبي شناخته شده بود و نتايج تغييرات انجام شده به راحتي از روي تغيير رنگ گلها قابل مشاهده است (19). آنتوسيانين داراي سـه ژن اصلي است: C (رنگ زا)، A (فعال کننده) و P (توزيع کننده). رنگيزه ارغواني در اندامهاي مختلفي از گياه برنج به جز ريشه ها و بساکها ديده ميشود (91 و 48). شناسايي مسيرهاي بيوسنتزي اين ژن ها به اهدافي چون، نقشهيابي ژن با مارکرهاي مولکولي کمک ميکند (81 و 82).
آزمايشهاي زيادي شامل افزايش بيان ژنهاي مختلف براي ايجاد رنگهاي جديد يا توليد تركيبات جديد در گياه انجام شده است. به خاطر خواص آنتي اكسيداني اين تركيبات افزايش ميزان توليد و مقدار آنها در غذاهاي گياهي موضوع جالب توجهي براي دانشمندان بوده است. در زمينه بيوسنتز فلاوونوئيدها و آنتوسيانينها اكثر پژوهشها در گياه گوجه فرنگي صورت گرفته است. مشخص شده است كه آنزيمي از گروه آيزومراز به نام CHI از آنزيمهاي مراحل اوليه مسير توليد فلاوونوئيد نقشي كليدي در افزايش توليد فلاوونول دارد. افزايش بيان ژن CHI گياه اطلسي باعث افزايش سطح فلاوونوئيد در پوست گوجهفرنگي به ميزان ?? برابر ميشود. همچنين با توليد گياهان گوجهفرنگي اصلاح شده، ميزان فلاوونوئيد آنها بيش از ?? برابر گياهان شاهد بوده است. اين موضوع ثابت کرد كه افزايش توليد تركيبات مفيد براي سلامتي در محصولات حاصل از گوجهفرنگي امكان پذير است. بيوسنتز ايزوفلاوونها كه تركيباتي ضد ميكروبي هستند، بر اثر آلودگي ميكروبي در حبوبات القا ميشود. افزايش بيان ژن ايزوفلاوون سنتتاز كه يك آنزيم سيتوكروم ??? Pاست، باعث توليد اين تركيبات در آرابيداپسيس، توتون و ذرت (18) )به طور عادي توانايي توليد اين مواد را ندارند( ميشود. توليد اين تركيبات در اين گياهان بستـگي به در دسترس بودن پيش مادههـاي مسيـر فنيل پروپانوئيد دارد. القا يا مهندسي اين مسير مي تواند در اصلاح و بهبود سامانه بيوسنتز ايزوفلاوون در گياهان ميزبان مهم باشد.
ژنهاي تنظيم كننده، توليد فلاوونوئيدها و آنتوسيانينها يك روش براي مهندسي بيان ژنهاي يك مسير بيوشيميايي استفاده از عوامل رونويسي خاصي است كه ژنهاي مسيرهاي بيوشيميايي متعددي را كنترل ميكنند (99). در دانه ذرت توليد آنتوسيانين توسط تركيبي از دو عامل رونويسي R و C1 تنظيم ميشود (77). القاي مسير توليد فلاوونوئيد با افزايش بيان اين دو عامل رونويسي R و C1 در سلولهاي تمايزنيافته ذرت در محيط كشت صورت ميگيرد (78 و 88). در برنج افزايش بيان اين دو عامل رونويسي مربوط به گياه ذرت (24) در كنار يك ژن ديگر باعث فعال شدن مسير بيوسنتز آنتوسيانين و همچنين افزايش مقاومت گياه برنج به قارچها ميشود. در آرابيداپسيس، يك عامل رونويسي از نوع MYB به نام PAP1 تشخيص داده شده است كه افزايش بيان آن باعث توليد رنگدانههاي بنفش پررنگ در زمان نمو گياه ميشود (53). اين مثالها نشان ميدهد كه مي توان با افزايش بيان يك يا چند عامل رونويسي (حتي با استفاده از ژنهاي بيگانه در گياه ميزبان)، بر اين سامانه قدرتمند تنظيمي ژنتيكي در هنگام نمو گياه، غلبه كرد.
2-5- برنج رنگي
توليد رنگ در اندامهاي مختلف يک گياه، نتيجه بر هم کنش رنگدانههاي مختلفي است که توسط گياه ايجاد ميشود. مهمترين رنگدانههايي که سبب ايجاد رنگ ميشوند. عبارتند از: پورفيرينها (Porphyrins)، کاروتنوئيدها (Carotenoids) و فلاوونوئيدها (Flavonoids). آنتوسيانينها گروهي از رنگدانههاي محلول در آب و متعلق به خانواده فلاونوئيدها هستند، وجود رنگدانههاي آنتوسيانين در برنج و ساير گياهان عامل اصلي توليد پايه ساقه ارغواني رنگ محسوب ميشود.
بين اندامهاي مختلف گياه برنج از نظر تشکيل رنگ و تراکم رنگيزههاي آنتوسيانين روابطي وجود دارد. زماني ژن آنتوسيانين در کلاله بيان ميشود که نوک دانه گياه نيز رنگي باشد، همچنين در گياهي با پهنک و پوشبرگ رنگي، نوک دانه و کلاله نيز رنگي خواهد بود. توليد رنگ ارغواني در زبانک و خوشه نيز مرتبط با توليد رنگ در پهنک و پوشبرگ گياه است. رنگ پايه ساقه در برنج رابطه مستقيم و قوي با تشکيل دانههاي رنگي در برنج دارد که در زير پوسته آنها به دليل تراکم متفاوت رنگيزه هاي آنتوسيانين در لايههاي مختلف پريکارپ، پوشش دانه و آلورون، رنگ هاي سرخ، ارغواني و سياه مشاهده ميشود.
برنجهايي که رنگ زير پوسته آنها، سرخ، ارغواني يا سياه بوده و حاوي مقادير زيادي از رسوبات رنگيزههاي آنتوسيانين در لايههاي مختلف پريکارپ، پوشش دانه، پايه گياه و آلورن ميباشند، به برنج هاي رنگي معروفند (55 و 44). محققان چيني اعتقاد دارند که برنج سرخ داراي مقادير زيادي از آهن و روي ميباشد، برنج ارغواني و سياه نيز از نظر عناصر کمياب گوناگون مانند: منگنز، کلسيم، موليبدن و ويتامينهاي C،B1 ، B6و B1 غني هستند (45 و 85). اين رنگ مربوط به برنجي است که فقط پوسته هاي اول آن يعني لما و پالئا جدا شده باشد. برنجهاي رنگي در ايران، به عنوان علف هرز ناميده ميشوند و مانند علفهاي هرز با آنها رفتار ميگردد. متأسفانه، اين نوع علفهاي هرز تا پيش از خوشهدهي قابل شناسايي نيستند. در جنوب شرقي و شرق چين، اغلب برنج سرخ، به زيرگونه هندي تعلق دارد. ارقام محلي سرخ در مقابل شرايط محيطي نامناسب مانند: خاکهاي نامرغوب و مناطق مرتفع، قابليت تحمل زيادي دارند. برنجهاي سرخ براي بهبود کيفيت خوراکي و پخت، در کارخانههاي شالي کوبي قابل تبديل به برنجهاي سفيد هستند. برنجهاي سرخ تبديل نشده به سفيد، خوش پخت نبوده و مصرف کننده آن را نميپسندد. ارقامي وجود دارند که تمام آندوسپرم دانه (درون دانه) آنها سرخ است و قابل تبديل به برنج سفيد نيست.
در سال 1993 در بانک ژن ملي گياهان زراعي چين 46000 رقم و در مرکز ذخاير توارثي مؤسسه بين المللي تحقيقات برنج 75000 رقم به ثبت رسيد. از ميان آن ها 583 رقم برنج سياه در جهان که از اين تعداد 359 رقم آن فقط در چين ثبت شد و بقيه آنها در سريلانکا ، اندونزي، هند، فيليپين و بنگلادش وجود داشت. اغلب اين برنجها داراي بافتي واکسي هستند (22).
2-6- نشانگرها در برنامههاي اصلاحي
2-6-1- تعريف نشانگر4
تفاوت بين توالي DNA کروموزومي هر موجود که از افراد به نتاج آنها منتقل ميشود، ميتواند بعنوان نشانه يا نشانگر ژنتيکي بکار گرفته شود. به طور کلي هر صفتي که بين افراد متفات باشد، ناشي از تفاوت موجود بين توالي DNA کروموزومهاي آنهاست. چند شکلي5 بودن و تفکيک پذيري از جمله شرايط لازم براي يک نشانگر ژنتيکي ميباشد (9). بنابراين، صفاتي مانند داشتن يا نداشتن ريشک و رنگ گلومل در دانـه برنـج که ميتوانند در بين دو والد در يک تلاقي متفاوت و به نتاج نيز منتقل شوند نشانگر ژنتيکي تلقي ميگردند (9).
2-6-2- انواع نشانگرها
2-6-2-1- نشانگرهاي موفولوژيکي6
صفات مورفولوژيکي که حاصل از جهشهاي قابل رؤيت در مورفولوژي سازواره7 بوده و عمدتاً توسط يک ژن کنترل ميشوند، به عنوان نشانگرهاي ژنتيکي مورداستفاده قرار ميگيرند. به همين منظور سيستم ارزيابي استاندارد (SES)8 در موسسه بين المللي تحقيقات برنج براي اندازهگيري اين صفات طراحي گرديد. اين نشانگرها عمدتأ متناظر با صفات کيفي هستنـد که بصورت عيني قابل رتبهبندي مي باشند. نشانگرهاي مورفولوژيکي غالباً تحت تاثير محيط قرار داشته، از سن سازواره متاثر ميشوند و گاهي براي مشاهده و ثبت آنها بايد منتظر ظهور آنها باقي ماند که در مورد گياهان چندساله، اين انتظار بسيار طولاني و مشکل خواهد بود. علاوه بر آن تعداد نشانگرهاي موفولوژيکي و چند شکلي آنها کم بوده و ضمن اينکه غالب ميباشند، اساس ژنتيکي بسياري از آنها هنوز مشخص نگرديده است (9). اين نشانگرها نمي توانند به ميزان کافي معيارهاي يک نشانگر ژنتيکي ايدهآل را تامين نمايند. فقدان دانش کافي براي کنترل ژنتيکي صفات فنوتيپي، تنوع ناکافي، زمان زياد براي رسيدن به مراحل رشدي مناسب، به همراه مشکلات ديگر، متخصصان اصلاح نباتات را به سمت نظامهاي نشانگري سريعتر و معتبرتر هدايت کرد.
2-6-2-2- نشانگرهاي سيتوژنتيکي9
تفاوت کروموزومي مشاهده شده در بسياري از موجودات ميتوانند به عنوان نشانگر به کار روند. تلوسنتريکها، ايزوکروموزومها، جابجاييها و الگوي نواربندي از جمله اين نشانگرها ميباشند (3). استفاده از اين نوع نشانگرها در گياهان به واسطه درجه پائين پليمورفيسم بسيار محدود ميباشد (9).
2-6-2-3- نشانگرهاي بيوشيميايي10
نشانگرهاي بيوشيميايي، پروتئينهايي هستند که در نتيجه بيان ژن به وجود ميآيند. اين قبيل نشانگر ها، نشانگرهاي مولکولي در سطح پروتئين (بيوشيميايي) ناميده ميشوند، که از آن جمله ميتوان به سيستم ايزوآنزيم (ايزوزايم)11 و آلوزايم12 اشاره نمود. اين پروتئينها از طريق الکتروفورز و رنگ آميزي، قابل جداسازي و تشخيص ميباشند. ايزوزايمها، فرمهاي مولکولي مختلف يک آنزيم با ماهيت پروتئيني هستند که واکنش يکساني را کاتاليز ميکنند (8). آلوزايمها نيز به همين شکل فراوردههاي آللهاي مختلف يک يا چند مکان ژني هستند (8). به دليل محدود بودن روشهاي رنگ آميزي پروتئينها در آيزوزايم، تعداد آيزوزايمهاي قابل ثبت و مشاهده که بتوان از آنها به عنوان نشانگر استفاده نمود، حتي به صد مورد هم نميرسد. عيب ديگر اين نشانگرها، محدوديت تنوع ژنتيکي قابل ثبت در آيزوزايمهاست (9). نشانگرهاي بيوشيميايي از اين نظر که مستقل از شرايط محيط رشد هستند، از نشانگرهاي مورفولوژيک برتر ميباشند. تنها مشکل ايزوزايمها در MAS اين است که بيشتر ارقام اصلاح شده تجاري داراي شکل واحدي هستند و آيزوزايمها نميتوانند مقادير بالايي از چندشکلي و همچنين چندشکلي موجود در ساختمان نخستين پروتئين (که سبب تغيير در عملکرد و بيان پروتئين مي گردد) را شناسايي نمايند. گذشته از اين، همه آنزيمها در تمام اندامها وجود ندارند يا در صورت وجود فعال نميباشند.
2-6-2-4- نشانگرهاي مولکولي
دستهاي از تفاوتهاي موجود در سطح مولکول DNA هيچ تظاهري ندارند، نه صفت خاصي را کنترل ميکنند و نه در توالي اسيدآمينه پروتئينها تاثيري بر جاي ميگذارند (8). اين گونه تفاوتها فقط از طريق تجزيه و تحليل مستقيم DNAقابل ثبت هستند و بنابراين به آنها نشانگرهاي مولکولي در سطح DNA اطلاق مي گردد (9). MAS يک



قیمت: تومان


پاسخ دهید